产品货号：
MT3201
中文名称：
G5S Plus超高保真DNA聚合酶
英文名称：
G5S Plus HiFi DNA Polymerase
产品规格：
100U|1000U
发货周期：
1～3天
产品价格：
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G5S Plus超高保真DNA聚合酶来源于高保真DNA聚合酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有超保真性能、长片段扩增能力、高产量、dUTP渗入能力、扩增含有尿嘧啶模板的能力。使用该酶可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。该酶具有4kb/min的延伸速度。该酶具有5'-3'的聚合酶活性、强3'-5'的外切酶活性，产物为平末端。
许多有高保真功能的聚合酶来为B型DNA聚合酶，在遇到DNA模板中的尿嘧啶碱基时停止复制。G5S Plus删除了尿嘧啶结合域，使其能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，该性能赋予其独特的“U”特征。其有两个重要的应用方向：
- 用于超保真扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损DNA；
- 在超保真扩增中搭配dUTP和热敏UDG，用于防止PCR体系中携带污染。除此外，也多用于USER克隆。
- 超保真扩增：与Q5 DNA聚合酶同水平的保真性能，是载体构建、点突变、NGS模板扩增、基因合成的最佳用酶。
- 识别dUTP底物：能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，具有“U”特征。
- 防污染扩增：在PCR扩增中可以使用dUTP完全替代dTTP，建立防污染高保真扩增。
- 快速扩增：具有4kb/min的扩增能力。
- 长片段扩增：质粒、λDNA等简单模板>20kb，复杂基因组模板>8kb。
一个活力单位即在72℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
| 组分 | 100U | 1000U |
| G5S Plus DNA Polymerase(2U/μL) | 50μL | 500μL |
| 5×G5S Buffer1 | 1.25mL | 15mL |
| 5×G5S Buffer2 | 1.25mL | 1.25mL |
保存：-20℃，有效期2年。
10mM Tris-HCl(pH7.6)，100mM NaCl，0.05% Tween20，1mM DTT，0.5mM EDTA，50%甘油。
- G5S Buffer 1用于4kb以下的片段扩增，及多重扩增，Buffer 1总能获得更特异的单一条带。
- G5S Buffer 2是高产PCR和复杂模版扩增的专用Buffer，用于4kb以上片段扩增，在扩增良好的引物条件下，Buffer 2总能获得更高的产量。
- 引物、模板、酶浓度使用参考表
在1×反应
体系下引物浓度
(nM)酶浓度
(mU/μL)模板浓度
(ng/μL)<4kb 200 20 基因组（0.01～1）
简单模板（0.01～0.1）>4kb 100 20～40 基因组（0.05～4）
简单模板（0.01～0.1） - 在进行防污染扩增时，dNTP中的dTTP可用dUTP来代替，dUTP占比75～100%。该酶可以用dUTP完全取代dTTP，扩增效率有所下降，但通常不影响下游应用(建议扩增片段<1kb)。在防污染扩增时，通常需要搭配热敏UDG酶来实现污染物的去除，热敏UDG的使用浓度通常为（0.01～0.05U/μL）。
- 扩增片段GC含量>65%时，推荐添加5×PCR增强剂至1×浓度，来提升高GC含量的扩增性能。
- 1×G5S Buffer 1和2，含有1.5mM Mg2+，必要情况下可调整用量。
- 按下表配制PCR反应液
成分 用量 终浓度 5×G5S Buffer 4μL 1× G5S Plus DNA Polymerase(2U/μL) 0.2μL 20mU/μL dNTP Mixture (10mM each) 0.4μL 200μM 上游引物（10μM） 0.4μL 200 nM 下游引物（10μM） 0.4μL 200 nM 模板DNA X μL ddH2O 至20μL - 推荐的PCR扩增程序
过程 温度 不同长度的模板DNA片段的时间参数 <0.5kb <1kb 1～2kb 2～3kb >3kb 预变性 95℃ 1min 1min 1min 1min 1min 循环1
(5个循环)95℃ 10s 10s 10s 10s 10s 65℃ 15s 30s 45s 90s 2kb/min 循环2
(23个循环)95℃ 10s 10s 10s 10s 10s 55℃ 10s 10s 10s 10s 10s 72℃ 15s 30s 45s 90s 2kb/min 终延伸 72℃ 1min 1min 1min 1min 1min - 在实际应用中，引物TM值（50～70℃）范围内均获得良好的扩增。该程序扩增总循环数为28（5+23），如产物扩增亮度不足，则增加循环2的次数到25～28个，通常不宜超过28。
- 如果仍然不能获得良好的扩增结果，则可以改变，循环2中的退火温度为50～65℃（上表中为55℃）。
- 在实际应用中，引物TM值（50～70℃）范围内均获得良好的扩增。该程序扩增总循环数为28（5+23），如产物扩增亮度不足，则增加循环2的次数到25～28个，通常不宜超过28。
- 不同长度片段的扩增图（最高到20kb）
G5S Plus扩增性能展示：500bp～8kb是以gDNA为模板进行扩增，15～20kb是以λDNA为模板进行扩增。酶的使用浓度为：0.02～0.04U/μL。 - 不同酶用量的扩增性能
以λDNA为模板(40pg/μL)扩增1kb的片段，在0.01U/μL的酶浓度下即可有效扩增。
以gDNA为模板(2ng/μL)扩增5kb的片段，在0.02U/μL的酶浓度下即可有效扩增。 - 模板扩增灵敏度展示
A.以gDNA为模板扩增500bp的产物，该酶可扩增低至10pg的gDNA(约3～5个细胞)
B.以gDNA为模板扩增2kb的产物，该酶可扩增低至100pg的gDNA(约30～40个细胞)。
酶的工作浓度为0.04U/μL。 - GC-rich模板的扩增
以人基因组DNA为模板扩增1250bp的高GC(67%)片段，在1×PCR增强剂的条件下，可扩增低至2ng的模板，酶的工作浓度为0.02U/μL。 - dUTP模板扩增性能
重硫酸盐处理DNA后，未发生甲基化的C碱基转化为U碱基，G5S Plus可用于高保真扩增DNA甲基化实验，扩增产物为500bp，酶的工作浓度为0.04U/μL。 - 高保真度扩增性能
使用DNA聚合酶对模板DNA进行35个循环的PCR扩增后，对PCR进行NGS测序，结果表明G5S Plus与Q5 DNA聚合酶保真度相当。
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